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神经退行性疾病研究最前线——第 3 回 阿尔茨海默症β-淀粉样蛋白

人阅读 发布时间:2018-01-03 09:36

东京大学研究生院药学系研究科 功能病态学课题组  堀 由起子、富田 泰辅
 
1. 序言 何谓β-淀粉样蛋白多肽 Aβ
 
阿尔茨海默症(Alzheimer disease;AD)患者的大脑中,老人斑是最显著的病理特征之一,是不溶性蛋白质异常聚集形成丰富的β片层结构的淀粉样纤维,并积累于脑实质细胞间隙的构成物。 通过近年来开发的淀粉样蛋白 PET 成像分析人脑内积累的老人斑发现,认知功能障碍症状出现前的 10-15 年,就能明显看到老人斑的出现,因此老人斑被认为是 AD 发病过程中的最早期病变。1984 年 Glenner 等人开始研究脑血管淀粉样蛋白,1985 年 Masters 等人开始研究老人斑淀粉样蛋白,对其进行分离纯化和氨基酸测定,证实老人斑的主要构成成分为β-淀粉样蛋白多肽(Aβ)。
 
Aβ 的肽链由约 40~43 个氨基酸组成。在 N 末端和 C 末端分别发生几种变异,老人斑积累的代表性物质 Aβ 包括由 40 个氨基酸组成且以 40 号 Val 残基结束的 Aβ 40 和由 42 个氨基酸组成以 42 号 Ala 残基结束的 Aβ。与 Aβ 40 相比,Aβ 42 的凝集性非常高,在老人斑形成早期就已经积累起来了。积累的 Aβ 一部分被修饰,存在 3 号 Glu 残基被 pyro 化修饰的 Aβ。

2. 淀粉样蛋白假说
 
AD 多数情况下为偶发性病症,但也有极小部分是以常染色体显性遗传的家族性 AD(Family AD;FAD)形式存在。从遗传学研究角度鉴定 FAD 的致病基因——编码 Aβ 前体蛋白(APP)的 APP 基因、APP 切断酶γ-secretase 复合体的活性中心蛋白被 PSEN 1 和 PSEN 2 基因编码的 Presenilin 1 和 2 识别。在上述 3 种遗传基因的基础上,对 FAD 家族进行研究发现 FAD 变异存在以下病变结果:①Aβ 产生总量增加;②高凝集性的 Aβ 42 产生比率增加;③Aβ 自体凝集性增强。 由此提出了 Aβ 的凝集•积累是诱发 AD 症的「淀粉样蛋白假说」。作为 APP 基因上的保护性变异,A673T 的变异会使 Aβ 产生减少,由此更强有力地支持了 Aβ 是 AD 发病机制的「淀粉样蛋白假说」。
大脑中 Aβ 的浓度是通过对其产生和清除进行平衡调节,一旦平衡被破坏了,就会出现 Aβ 在脑内聚集的局面。本文通过 Aβ 的产生、清除和聚集三方面,靶向治疗 Aβ 展开论述根治 AD 的方法。

3. Aβ 的产生过程
 
Aβ 是由其前体蛋白 APP 切断出来的肽链片段。APP 是 I 型单向膜贯通性蛋白质,普遍存在于各个组织中。根据氨基酸剪接不同主要分为 695/751/770 三种氨基酸类型,但在大脑中发现较多的是 695 氨基酸的 APP695。
 
在健康的人脑脊髓液中也可检测出 Aβ,它并不是 AD 病患者脑中病变产生的产物,而是 APP 正常代谢过程中产生、分泌的分子。Aβ 是通过对 APP 2 阶段的剪切后产生的(如图 1)。首先,APP 的细胞外域被β-secretase 切断,细胞外域片段(sAPPβ)被分泌出来。然后γ-secretase 切断残留在细胞膜的 APP 的 C 末端断片(C99),并产生 Aβ 和 AICD。Aβ 的 C 末端变异是γ-secretase 切断时引起的,氨基酸切断的部位不同,可以产生 Aβ 37 到 Aβ 49 等多种 Aβ。以前人们瞩目于高产生量的 Aβ 40,或聚集性•毒性高的 Aβ 42,但近年来,聚集性•毒性高的 Aβ 43 也备受瞩目。另外,除了γ-secretase 的切断抑制作用,对于其切断活性调节的γ-secretase modulator(GSM)的开发和功能机制的研究也在进行中, Aβ 37 和 Aβ 38 的短 Aβ 种类的产生机制也受关注。β-secretase 的分子形态是以 BACE1 为活性中心,Aph-1、Pen-2、nicastrin 的复合体;γ-secretase 是以 presenilin 1 或 presenilin 2 为活性中心的,与 Aph-1、Pen-2、nicastrin 组成的复合体。
 
APP 代谢过程中,除 Aβ 产生途径外,还存在非 Aβ 产生途径(如图 1)。非 Aβ 产生途径也分为 2 个阶段的剪切,第 2 阶段的剪切酶同样是γ-secretase,但第 1 阶段的剪切酶为α-secretase。α-secretase 是在 APP 上的 Aβ 内域 16 号 Lys 残基和 17 号 Leu 残基间切断的, 产生的约 3kDa 的片段(p3)是缺失 Aβ N 末端域 16 氨基酸的多肽片段。神经细胞中的 ADAM10 就是主要的α-secretase。
图 1. Aβ 产生途径和非 Aβ 产生途径
 
(A) Aβ 产生途径模式图。APP 被β-secretase、γ-secrease 切断产生 Aβ(Aβ 产生途径);被α-secretase、γ-secretase 切断则产生 p3(即非 Aβ 产生路径)。
 
(B) Aβ 序列及其切断部位图像。蓝色部分表示 Aβ 序列。
 
近年来有报道指出,Aβ产生量是随神经活动的变化而变化的。在小鼠脑内可明显观察到,脑部位的神经活动量和 Aβ 产生量、Aβ 积累量相关,小鼠进入睡眠状态时,神经活动受到抑制,Aβ 产生量也明显减少 14、15)。利用光遗传学技术使神经活动长期处于连续亢奋的状态,则发现 Aβ 积累量增加 16)。虽然通过增强神经活动使 Aβ 产生的机制尚未明确,但随着神经活动亢奋,内吞作用增强可能使得被运送至细胞表面的 APP 更容易被内吞作用以及被 BACE1 切断。

4. Aβ 清除过程
 
通常情况下,可以通过迅速清除脑内产生的 Aβ,来维持大脑内 Aβ 的一定浓度。但是在一部分的 FAD 患者中,FAD 的变异结果使 Aβ 产生量增加,破坏脑内 Aβ 平衡,引发 AD 症。另一方面,在偶发性 AD 患者群中发现,AD 症的突破点不在 Aβ 产生的增强,而是 Aβ 的清除 17)。这个结果表明除了 Aβ产生过程,Aβ清除过程的详细分子机制研究也至关重要。报道指出,Aβ 分解酶的分解、胶质细胞的吞噬作用、通过血脑屏障(BBB)的排出输送等都可作为 Aβ 清除的主要机制。
 
代表性的 Aβ 分解酶有:金属蛋白酶——Insulin degrading enzyme(IDE)和 Neprilysin(NEP),丝氨酸蛋白酶——Kallikrein-related peptidase 7(KLK7)等 18, 19, 20)。从基因敲除小鼠案例中阐明了二者都能分解小鼠脑内的内源性 Aβ,还可以减少 AD 患者脑内的 Aβ 量,降低其分解活性。另外,使用腺病毒相关载体表达 NEP 等也可以减少 Aβ 的积累 21),更表明了这些 Aβ 分解酶可能成为 AD 病症治疗的标靶。
 
脑内的小胶质细胞和星形胶质细胞等胶质细胞吞噬 Aβ 也被推断出来。在小胶质细胞中,发现了与 Aβ 吞噬作用有关的 scavebger receptor 等受体。加之近年来从胶质细胞相关研究发现的可能与 AD 风险相关基因群(Genome wide association study;GWAS)中,发现小胶质细胞中含有多种高表达的遗传基因 22),这些胶质细胞可能以某种形式影响着 AD 症的发病。实际上,这些遗传基因中,关于 CD33 和 TREM2 等对 Aβ 清除造成的影响已被报道 23, 24)。
 
5. Aβ 凝集过程
 
Aβ 单体中,没有特定结构,聚集、积累后 Aβ 形成了丰富的 β 片段构造的淀粉样蛋白纤维。Aβ 42 的聚集性比 Aβ 40 高,是脑内老人斑形成时最先积蓄的一种 Aβ。Aβ 40 比 Aβ 42 结构更容易发生改变,虽然原因暂时不明,但已有报道指出 31-34 号、38-41 号氨基酸残基上组成β发夹结构可稳定 C 末端结构,使其更易形成β片段结构 27)。在 Aβ 分子内,淀粉样蛋白纤维与 25-29 号氨基酸组成转角结构形成β片段结构,通过分子间相互作用形成β交叉片段 25、26)。组成分子内转角结构的氨基酸域附近是增强 Aβ 聚集性效果的基因变异集中的热点部位,可从结构侧面推测出这些变异可促进 Aβ 的结构变化和纤维加速形成。
 
Aβ 形成淀粉样蛋白纤维的过程,可以建立体外实验的核形成过程和伸长过程的模型 28)29)。核形成过程就是 Aβ 单体发生结构变化并发生核纤维伸长形成聚合(seed)的最初过程,是一个缓慢进行的淀粉样蛋白形成过程。Aβ 42 的这个成核过程比 Aβ 40 要早。持续伸长过程是以形成的 seed 为起点,Aβ 通过结构变化依次结合使纤维快速伸长的过程。在体外,单独孵育 Aβ 40 聚集进展缓慢,预先添加纤维化的 Aβ 可以加速聚集速度。同样在体内,将 AD 患者脑来源或带有 Aβ 积累的 AD 模型小鼠来源的脑裂解液注入不带 Aβ 积蓄的小鼠脑中,注入的 Aβ 作为 seed 在脑中促进 Aβ 的积累 30)。由此证明了 seed 形成在 Aβ 积累中的重要性。上述的 AD 患者脑来源的 Aβ 淀粉样蛋白结构分析中,淀粉样蛋白结构并非相同的,病变过程不同的患者可能产生不同的淀粉样蛋白构造,由此也可证明最初形成 seed 结构的重要性。
 
初期提到的《淀粉样蛋白假说》提出 Aβ 积累形成老人斑,是 AD 症发病的原因。但是,老人斑和认知功能衰退之间并无明确的相关性、比起淀粉样蛋白纤维 oligomer 等 Aβ聚集中间体具有强毒性被明确后,现在已将《特别是聚集中间体发挥着强毒性》作为《淀粉样蛋白假设》的一部分修改形式。Aβ 聚集中间体与使淀粉样蛋白纤维构造不溶的 Aβ 不同,是可溶的低分子量 Aβ 重组体。有报告指出可溶性中间体在体外试验中有 paranuclei、protofibrils、Aβ-derived diffusible ligands(ADDL)等 Aβ 聚集中间体 31)、32)、33)。在体内,除了 dimer 和 trimer 等 low-n oligomer 外,还检测到用 12-mer 组成的 56kDa 的 Aβ 34、35)。这些 Aβ 凝集中间体的共同性是带有强烈的突触功能障碍和细胞毒性,其形成机制和性质很耐人寻味。

6. 以 Aβ 为治疗靶点的 AD 根本治疗法
 
以《淀粉样蛋白假说》为立足点,人们提出各种以 Aβ 为治疗标靶的 AD 根本治疗法。主要是①抑制 Aβ 产生、②促进 Aβ 清除、③抑制 Aβ 聚集为目的研究,虽然经过基础实验水平探索、检测了一些候补化合物,但以下记载的两个观点是专门进行临床实验的。
 
第一是以抑制 Aβ 产生的各个 secretase 活性抑制法。但是γ-secretase 除了含有 APP 外还有各种切断底物,特别是切断 Notch 会造成很大副作用。因此不能使用γ-secretase 抑制剂,而是寻求开发以调节切断活性为目的的,可特异性减少 Aβ 42 产生的γ-secretase modulator(GSM)。另外,作为β-secretase 的 BACE1、BACE1 敲除小鼠没有出现 presenilin 敲除小鼠的异常表现型,β-secretase 切断限制 Aβ 产生过程,因此 BACE1 抑制剂有望成为 AD 治疗的有效药物。
 
第二是促进 Aβ 清除。这个观点在临床实验中有抗 Aβ 抗体被动免疫法和 Aβ 疫苗主动免疫法。1999 年,Schenk 等人提出了在 APP 转基因小鼠体内免疫 Aβ 聚集,可以减少脑内 Aβ 积累的报告 36)。之后还提出注射抗 Aβ 抗体,可也达到同样效果 37),通过抗 Aβ 抗体也可以促进 Aβ 清除。尽管清除机制尚未完全明确,但是可认为活化了小胶质细胞活对 Aβ 的吞噬作用,促进 Aβ向末梢延伸。对极少量抗体转移至脑内和抗体表位引起的效果差异,仍需要详细的机制说明。
 
这些以 Aβ 为目标的治疗药正在临床实验的困境之中,而造成这个局面的原因之一是治疗开始的时间太晚。前面所提到的老人斑是在认知功能障碍显现的 10~15 年前就开始积蓄,对表现出认知功能障碍且已演变为 AD 病症的患者,单纯以 Aβ 为目标的治疗策略不一定能改善 AD 症状。因此可在 Aβ 积累开始的未发病期或早期的临床前阶段进行预防性干预,开展预防性医疗 38、39)。为了使治疗策略有效执行,必须开发 Aβ 积累的早期诊断方法,如开发简便的 Aβ 淀粉样蛋白图像诊断法和生物标记法等。
 
7. 结语
 
从多年来对 AD 相关基础研究结果看,将 Aβ 作为 AD 发病原因的「淀粉样蛋白假设」和以 Aβ 为靶标的治疗策略有一定的合理性。但尚不能作为 AD 根本治疗方法,需要进一步对影响 AD 症的 Aβ 做详细的分子机制及临床应用研究。
 
【参考文献】
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31)Walsh, D. M. et al. : J. Biol. Chem., 272, 22364-22372(1997).
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34)Shankar, G. M. et al. : Nat. Med., 14, 837-842(2008).
35)Lesne, S. et al. : Nature, 440, 352-357(2006).
36)Schenk, D. et al. : Nature, 400, 173-177(1999).
37)Bard, F. et al. : Nat. Med., 6, 916-919(2000).
38)Sperling, R. et al. : Neuron, 84, 608-622(2014).
39)Reiman, E. M. et al. : Nat. Rev. Neurol., 12, 56-61(2016)

Aβ 相关试剂

日本和光有 Aβ 相关试剂产品系列。
 
产品编号 产品名称 克隆号 抗原表位 子类 适用实验 与 Aβ 肽的反应性 规格 容量
小鼠/大鼠
Aβ1-40 Aβ1-42 Aβ1-43 Aβ1-40 Aβ1-42 Aβ1-43
017-26871 Anti Human Amyloid β, Monoclonal Antibody(BAN50)

抗人β-淀粉样蛋白,单克隆抗体(BAN50)
BAN50 Aβ N末端1-16 小鼠
IgG1·κ
WB/IHC/IP/ELISA × × × 免疫化学用 10 μL
013-26873 50 μL
014-26881 Anti Amyloid β, Monoclonal Antibody(BNT77)

抗淀粉样蛋白β,单克隆抗体(BNT77)
BNT77 Aβ11-28 小鼠
IgA·κ
IHC/IP/ELISA 免疫化学用 10 μL
010-26883 50 μL
018-26921 Anti Amyloid β40, Monoclonal Antibody(BA27)

抗β-淀粉样蛋白40,单克隆抗体(BA27)
BA27 Aβ40 C末端 小鼠
IgG2a·κ
WB/IHC /ELISA × × × × 免疫化学用 10 μL
014-26923 50 μL
014-26901 Anti Amyloid β42(43), Monoclonal Antibody(BC05)

抗β-淀粉样蛋白42(43),单克隆抗体(BC05)
BC05 Aβ42 C末端 小鼠
IgG1·κ
WB/IHC /ELISA × × 免疫化学用 10 μL
010-26903 50 μL

抗体
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