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什么是外泌体？
人阅读 发布时间：2018-03-02 11:03
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金泽大学医学系免疫学 教授
華山 力成 |
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近年来，细胞外囊泡（EV）研究正加速发展。5 年前每年有约 200 篇相关论文发布，但 2016 年一年间有 1 000 篇以上的相关论文发布，论文内容涉及各种生理功能和病理症状。EV 大致可分为核内体来源的外泌体和细胞质膜来源的微囊泡，但即便是用现在提取精度最高的差速离心法也难以将二者明确分离，所以简单地将 10 000×g 离心后未沉淀的 EV 称为 small EV（主要是外泌体）1)。外泌体是由各种细胞分泌的小型膜囊泡（直径 30~100 nm），存在于大多数体液（如血液、尿液、髓液等）和细胞培养液中。外泌体是由脂质双层膜包被的膜囊泡，产生于称为多囊泡性内体的细胞外囊泡中，多囊泡性内体通过与细胞膜融合将外泌体释放到细胞外。外泌体含核内体来源的蛋白质（如 ESCRTs 和 TSG101 等）和细胞内运输相关蛋白（如 Rab GTPase 等）、以及细胞膜来源蛋白（如 CD63, CD81 等）等为首的各种内分泌细胞来源的蛋白和 RNA，同时还含分泌细胞细胞膜来源和内体膜来源的脂质（如胆固醇和鞘磷脂等）2)。多年来，外泌体被认为参与无用的细胞内含物质的释放。但是近年来，外泌体在活体内作为运载脂质、蛋白质、RNA 等细胞间信息传递的新型媒介，倍受瞩目。随着其生理或病理功能的阐明，外泌体在临床应用研究中，特别是诊断治疗、生物标记的开发中的功能也迅速发展起来。
现在，外泌体研究横跨几乎所有的研究领域（免疫、神经系统、癌症、内分泌、循环系统等）。例如，免疫细胞来源的外泌体含有抗原肽/MHC 复合体和各种抗原，可能控制着免疫细胞间抗原信息的交换、免疫细胞活化、非活化等各种免疫应答机制3)。外泌体在神经系统中与神经回路的控制相关，同时各种神经退行性疾病的致病蛋白还可以通过外泌体释放到细胞外并传递到其他细胞，与病情发展密切相关5)。 癌细胞释放的外泌体含有多数与血管新生和免疫逃逸相关的分子，构建适合癌细胞生长的微环境，促进癌细胞的发展6)。另外，癌细胞来源的外泌体上的粘着分子表达形式决定着癌症向器官的转移途径7)。最近，有报告指出脂肪细胞释放的外泌体对肝脏的遗传基因表达有控制作用8)。许多病毒利用外泌体的产生路径感染细胞，受病毒感染的细菌和寄生虫通过外泌体控制其他受细胞感染的细菌、寄生虫的活动9、10)。
上述这些功能几乎都是通过细胞分泌到外泌体中的分子引起的。其中，由于已发现外泌体内含有分泌细胞来源 mRNA 和 miRNA，因此外泌体与细胞间遗传信息表达水平和传递的相关性而倍受瞩目11)。这些 RNA 被外泌体的脂质双层膜所保护，不会被 RNase 所分解，可以在血液和体液中稳定存在。被靶细胞吞噬的外泌体通过与内体膜融合，将 RNA 释放到靶细胞的细胞质中。释放出来的 mRNA 翻译为蛋白质，但 miRNA 抑制目的基因的翻译，因此外泌体在靶细胞内控制基因的表达。一个外泌体所含蛋白质有数万种，mRNA、miRNA 的种类有数千种以上，它们的结构除了受来源细胞不同影响外，还受到细胞状态不同的影响。另外，外泌体中这些物质的结构与它们在分泌细胞内的结构不同，所以可能存在一种外泌体特异蛋白和 mRNA/miRNA 选择性积累的机制。这种特异性可将外泌体内的 RNA 作为生物标记，更进一步作为治疗开发的靶点。外泌体中的 mRNA 一旦被靶细胞吞噬，能够引起这个细胞内的功能性蛋白的表达，但外泌体中多数的 miRNA 是前体而非功能性 miRNA，这些 miRNA 起着何种生理性意义，正在被学者们研究。由于外泌体含有各种蛋白质、RNA 和脂质，研究人员正将其进行细胞分类，建立数据库（ExoCarta）。此外，在世界各地分别进行着运用蛋白质组学和转录组学、系统生物学的大规模分析工作，而 FunRich 的 EV plugin 作为一种通用的分析手段已被公布出来。今后，在推进外泌体研究方面，各领域的研究人员信息共享至关重要。
参考文献：
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17) Nakai W, et al.（2016）A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci Rep, 6 : 33935.
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MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS 提取高纯度完整状态的外泌体。
外泌体是各种细胞外泌的直径在 30～100nm 之间的膜囊泡。因外泌体内含 mRNA、microRNA 等核酸和蛋白质对相邻细胞具有交换信息的功能。作为细胞间信号传导的通讯工具和作为癌等各种疾病的生物标记话题比较热门1、2)。近些年关于外泌体研究很广泛，但是关于外泌体相关的实验技术，关于需要改进的课题存在很多。
例如，外泌体提纯方法中，超速离心法和聚合物沉淀法（市售试剂盒）混入多种杂质，给后续实验产生了许多障碍。抗体亲和法和密度梯度离心法，虽然可以提取到高纯度的外泌体，但不能提取完整外泌体，无法分析外泌体具有的生理功能，也是两种提取方法的问题所在。而免疫印迹法（WB）和 Elisa 检测法作为被广泛应用的外泌体检测的一般方法，又存在检测时需使用大量外泌体和难以检测到低表达水平的标记蛋白。
为了解决外泌体实验遇到的上述的各种问题, Wako 研发出 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS（MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS）提取高纯度细胞外囊泡。
外泌体膜含有分泌细胞源的蛋白和脂质，众所周知磷脂酰丝氨酸（PS）在活细胞通过翻转酶作用导向细胞膜内侧，暴露在外泌体膜外侧3)。另外，T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4（Tim4 通过巨噬细胞进行细胞凋亡的吞噬受体）蛋白通过细胞外域 IgV 域与含有钙离子的 PS 结合4)。
基于上述知识，我们利用 Tim4 固化磁珠，在钙离子存在下捕捉培养上清和血清等样品中的外泌体，再添加螯合剂洗脱外泌体，这种外泌体纯化方法是和金泽大学医学系免疫学华山教授共同开发，并取得了成功。5)这是迄今为止取代黄金标准超速离心法的新型外泌体纯化方法。
参考文献：
1) Tkach, M. et al. Communication by Extracellular Vesicles : Where We Are and Where We Need to Go. Cell 164, 1226-1232（2016）.
2) Raimondo, F. et al. Advances in membranous vesicle and exosome proteomics improving biological understanding and biomarker discovery. Proteomics 11, 709-720（2011）.
3) Trajkovic, K. et al. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science 319（5867）: 1244–7（2008）.
4) Miyanishi, M. et al. Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor. Nature 450, 435-439（2007）.
5) Nakai, W. et al. A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci. Rep. 6, 33935（2016）.
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 采用磷脂酰丝氨酸（PS）亲和 Tim4 蛋白的 PS 亲和法，可方便获得高纯度的外泌体和其他来自细胞培养基和体液的 EVs。提取的完整外泌体和其他 EVs 可用于不同实验：电镜分析，纳米粒子追踪分析，EVs 的操作和分析等。
【特点】
●可提取高纯度的完整外泌体
●可从血清、血浆、尿液等样品中提取外泌体
●重复性高，回收量稳定
●操作简单，可处理多个样品（无需超速离心）
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