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石蜡切片骨相关酶(TRAP,ALP)双重染色

人阅读 发布时间:2020-09-10 09:52

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东京大学医学部附属医院 整形外科脊椎外科 第2研究室 河源 元

 

 

1.前言

 

  检测相关细胞的生理活性是掌握生物体骨代谢状态的有效方法。骨组织使用碱性磷酸酶(ALP)进行染色可明确成骨细胞的成骨潜能,使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色可明确破骨细胞的骨吸收能力。并且在同一切片上进行二重染色时,可同时识别二者。另外,本产品还具有使用脱钙标本进行二重染色实验,无需特殊机器,在一般的设施上即可观察骨代谢等特点。在这样的背景下进行二重染色的研究。

 

 

2.标准标本的制作

 

  用之前使用的树脂包埋法或冷冻切片法制成的标本作为标准标本,和脱钙石蜡切片相比。即酒精固定小鼠肘关节,用乙二醇甲基丙烯酸树脂包埋,硬组织切片机制作2μm切片,然后进行TRAP和ALP染色(图1)2)。再制作脱钙冷冻切片(图2)作为标准标本。然后,研究或改良固定、脱钙、染色等各阶段双重染色的可行性。

 

 

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图3.本实验标准标本——小鼠肘关节染色标本。

左图为TRAP染色,右图为ALP染色。下图是二者的双重染色

染色效果均佳。以此作为阳性对照,与脱钙石蜡切片一起染色,进行染色性评估。

 

 

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图2.脱钙冷冻切片酶染色—将柠檬酸脱钙的小鼠腰椎

和右上肢浸泡在30%蔗糖溶液,后经OCT复合包埋,

Tissue‐tekPINO冻结,Cryo3制作5μm冷冻切片。再对切片进行酶染色。

不仅可进行TRAP染色(左:红色)和ALP染色(中:褐色)的单染色,双重染色(右)也呈阳性。

 

 

3.固定

 

  ALP染色使用不能用福尔马林固定的新鲜材料,如果未在短时间内固定,会导致酶失活,因此推荐80%乙醇固定。①小鼠膝关节不进行一次固定,直接用乙醇直接浸泡进行二次固定组。②小鼠腰椎用福尔马林(4% Paraformaldehyde Fix Solution)固定16小时后再用乙醇进行二次固定。③小鼠腰椎用福尔马林固定4天后进行二次固定。④临床案例也用福尔马林固定1个月后,再进行二次固定。对上述四种类型进行TRAP·ALP双重染色,研究染色的可行性。图3是各染色性的研究结果。本实验证明福尔马林固定从16小时到4天时间范围内均可进行TRAP·ALP双重染色。

 

 

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图3.福尔马林的1次固定的固定时间和TRAP/ALP的染色性研究

①是未经福尔马林固定,仅用酒精2次固定的样品,ALP染色呈强阳性。TRAP染色呈阴性。

②是福尔马林固定16小时和③是固定4天,TRAP/ALP的染色效果均佳。

并且,福尔马林固定1个月的临床案例(骨软骨瘤)中TRAP染色呈阳性,但不能ALP染色。

 

 

4.脱钙

 

  ALP酶是含有金属Zn蛋白。通过脱钙处理,酶的组成成分Zn被去除,导致酶失活。为弥补此缺点,需要添加ZnSO4,作为ALP活化剂。换言之,100mL脱钙液需添加0.4mL  1%ZnSO4,来补充Zn离子。并且,作为脱钙剂,在柠檬酸盐酸缓冲液添加Zn的同时,也可尝试添加相同螯合剂EDTA溶液进行研究。另外,也可研究能否在酸性脱钙剂(甲.酸福尔马木木溶液)进行酶反应。结果显示,脱钙液添加EDTA溶液后染色良好。反之,甲.酸福尔马木木溶液不能进行酶染色(图4)。脱钙方法利用超声波脱钙装置(Histra-DC,正常光)在8~16℃的低温环境下,连续操作3-6天,对样品进行脱钙处理。脱钙后用添加甘氨酸的Barbital缓冲液(pH7.4)清洗,磷酸钙附着在组织上,防止沉淀。

 

 

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图4.脱钙液的种类不同可否双重染色

左图是选用酸性脱钙溶液中对组织伤害较少的甲.酸福尔马林

脱钙溶液脱钙3天(Histra-DC,8~16℃)后的大鼠膝关节。

(Histra-DC,8-16℃)TRAP和ALP均不能染色。相对来说,中图、右图均可进行TRAP/ALP双重染色。

 

 

5.染色

 

  染色法是Lorch的Gomori法。本次用的是偶氮染料法和耦合法结合的TRAP/ALP染色试剂盒(Wako,产品编号:294-67001)。Lorch推荐切片厚度为8μm,同时也研究了普通的4μm切片是否能染色、双重染色的顺序应该先染TRAP和ALP中的哪一个、封片剂是否必须选水溶性封片剂等问题。

  染色法结果:偶氮染料法中切片过厚导致酶扩散图像。即用TRAP染色骨质有红染倾向,但即使是4μm厚度,只要增强反应条件(反应温度和反应时间),也能充分染色的。换言之,TRAP染色中反应温度从室温调至37℃,反应时间从30分钟调至45分钟或60分钟。ALP染色在37℃反应45分钟至3小时,或者室温(10-15℃)下反应时间增加至一晚。此结果显示,两者色调平衡,染色效果好(图5)。但是,反应条件的增强导致ALP染色切片产生了很多色素颗粒(图2)。另外,TRAP和ALP的染色顺序哪一个先染色都是可以的。如果先进行ALP染色时,在TRAP阳性部位呈明显的红色,鲜艳处为破骨细胞。获得比较好的标本。但是,ALP的反应产物经过TRAP溶液处理后,会产生白色混浊颗粒,沉淀在组织上。因此,先TRAP染色,接着ALP染色的方法是可行的。封装法是利用甲基绿数秒间核染色处理。水洗后,37℃下干燥,二甲.苯浸透,用马里醇(Marinol)封存。有文章推荐在浸透前用推荐使用酒精脱水,但是会产生反应产物的溶解、扩散。

 

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图5.脱钙石蜡包埋切片的TRAP/ALP双重染色

用1年龄小鼠腰椎的EDTA脱钙石蜡切片,进行TRAP/ALP双重染色。

TRAP阳性将破骨细胞染成红色,ALP阳性将细胞活性强的细胞(成骨细胞、软骨细胞)染成褐色。

(上:弱扩大,下:强扩大)

 

 

6.总结

 

  TRAP和ALP的双酶染色实验中通过对固定、脱钙、染色进行多处改良,实现了对脱钙石蜡标本的染色。但是酶扩散图像对TRAP染色的效果显著。出于各种原因的考虑,关于固定步骤的影响,如果固定不充分的话,容易抑制脱钙水平。进而导致酶扩散的发生。另外,注意脱钙本身的影响也是有必要的。总而言之,和非脱钙标本相比较,脱钙标本的扩散图像更加明显。脱钙会是酶扩散变强。另外,我们将在今后对切片的厚度和二重染色顺序的影响进行着重研究。

 

 

7.产品列表

 

产品编号

产品名称

规格

包装

294-67001

TRAP/ALP双重染色试剂盒

TRAP/ALP Stain Kit

病理研究用

60次

 

 

【参考文献】

[1] 須田立雄、小澤英浩、高橋栄明著:「骨の科学」(医歯薬出版)(1985).

[2] 河原元:技術講座、続・病理組織標本作製完全マニュアルシリーズ第2回硬組織検査法,

   MedicalTechnology,24(12),カラーアトラス、1213-1222(1996).

[3] 「骨形態計測ハンドブック」第1版,p.67(1983)

[4] 末吉徳芳ら:技術講座、組織固定法—より良い固定を目指して,MedicalTechnology,

   37(8),857-864(2009).

[5] Localization of AlkalinePhosphatase in MammalianBones by I. JOANLORCH

[6] Conyers,R.A.J.:Biochem.Biophys.Acta(Amst),138,363-371(1976)

[7] Gomori,G.:Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.,42,23(1939)

[8] Barka,T.and Anderson,P..:J.Histochem.Cytochem.10,741(1962)

[9] 影山圭三、渡辺陽之輔:「病理組織標本の作り方」,慶応義塾大学医学部病理学教室編,

   第5版(医学書院)(1986).

 

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