对去外泌体FBS中外泌体残留量的评估

— 高灵敏度外泌体检测技术，全新的质量保证 —

 

 

富士胶片和光纯药 生命科学研究所 笹本宏大

 

 

◆前言

 

由各种细胞释放的囊泡和外泌体，近年来不仅在理解生命现象的基础研究领域，而且在诊断和治疗等研究领域也备受关注。在获取和分析细胞培养来源的外泌体时，通常会使用添加了胎牛血清（Fetal Bovine Serum : FBS）的培养基。虽然使用的胎牛血清在细胞培养时已去除外泌体，但并没有详细验证过是否有外泌体残留，也没有讨论过对后续实验是否有影响。因此，本文介绍了使用 FUJIFILM Wako 的高灵敏度外泌体检测技术，对去除外泌体的 FBS 中外泌体残留量的结果进行了比较分析。

 

 

◆外泌体

 

外泌体是由细胞释放的直径为 30-100 nm 左右的膜囊泡，并将 CD9、CD63 和 CD81 作为标记蛋白 ¹）。外泌体含有蛋白质、核酸（DNA、RNA、miRNA）、以及脂质等细胞来源成分，研究认为它通过将这些成分传递给其他细胞来进行细胞间的信息传递。从它被释放至胞外的特点来看，可以确认在血液（血清和血浆）、尿液、唾液等体液中也存在外泌体。另外还有报告称外泌体可以作为癌症等疾病的生物标记，因此近几年的关注度明显攀升 ^2,3）。

 

 

◆关于外泌体研究中的FBS

 

在外泌体的研究中，分析时通常会使用培养上清中纯化获得的细胞来源外泌体。在一般的细胞培养中，经常会使用添加了 FBS 的培养基，但在以获取细胞来源外泌体为目的的培养中，为了防止混入 FBS 中大量的牛来源外泌体，会使用无血清培养基或已去除牛来源外泌体的 FBS 培养基。去除了外泌体的 FBS，一般是使用自己用超速离心法去除外泌体的 FBS，以及标明已去除牛来源外泌体的品牌。而且这一类产品的质量保证，是通过检测残留外泌体的粒子数和 miRNA 含量，以及使用 Western blotting 和 ELISA 试剂盒等检测标记蛋白来确认残留外泌体的数量。

 

 

◆利用PS亲和ELISA高灵敏度检测FBS中牛来源的外泌体

 

FUJIFILM Wako 开发了 PS 亲和法可以用于外泌体的分离，此外 PS 亲和 ELISA 还可以进行外泌体的定量分析 ⁴），该方法的原理是利用存在于外泌体表面的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine : PS），在钙离子存在下能结合 Tim4 蛋白。关于 PS 亲和 ELISA，首先添加培养上清、血清等含外泌体的样品至固定了 Tim4 蛋白的孔板，接着在钙离子存在的条件下捕获外泌体，然后通过和外泌体表面标记蛋白反应的抗体进行检测。该方法的检测灵敏度约为 Western blotting 的 1,000 倍以上，约为固定了外泌体表面标记抗体的现有 ELISA 试剂盒（检测灵敏度为几 ng～ 几 μg 左右）的 100 倍以上（图 1）。

 

 

图 1. 比较 Western blotting 与 PS 亲和 ELISA 检测的灵敏度

 

（a）PS 亲和 ELISA 的原理：利用识别表面抗原的抗体来检测固定化 Tim4 蛋白捕获的外泌体并进行定量分析的方法。

（b）利用免疫印迹检测外泌体的灵敏度：分别取 50、75、100、200 ng COLO201 细胞来源纯化外泌体（使用 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS）进行电泳，使用抗 CD63 抗体进行 Western blotting 检测。检测下限在 75 ng 左右。

（c）PS 亲和 ELISA 的检测范围：仅检测 K562 细胞和 COLO201 细胞来源纯化外泌体（使用 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS）梯度稀释后的样品和缓冲液的空白值的活性，然后根据检测结果，计算各样品的最低检测灵敏度（各浓度点在 n = 6、A0 点在 n = 12 时测定）。K562 细胞来源外泌体的检测下限在 49.9 pg，COLO201 细胞来源外泌体在 10.9 pg 左右。

 

 

另外 FUJIFILM Wako 还对抗外泌体表面标记蛋白 CD9、CD63、CD81 的单克隆抗体进行了商品化。其中的抗 CD9，单克隆抗体（1K）及抗 CD81，单克隆抗体（17B1）均对牛抗原具有交叉性，利用上述 PS 亲和 ELISA 检测抗体，可高灵敏检测 FBS 中所含的牛来源外泌体。
 

因此，这次 FUJIFILM Wako 使用高灵敏度外泌体检测技术，比较分析了超速离心处理去除外泌体后的 FBS 和其他品牌中已去外泌体 FBS 中牛来源外泌体的残留量（图 2）。结果发现，众多论文所使用的产品，无论是使用超速离心法去除外泌体的 FBS，还是其他声称已去除外泌体的 2 种产品，仍残留了大量的牛来源外泌体（图 2（a）。另一方面，实验也确认了 FUJIFILM Wako 准备在日本推出的 BioSera 品牌 Exosome-Depleted FBS 中，几乎没有检测到残留的牛来源外泌体（图 2（a））。
 

另外，在评价培养人胚胎肺来源的正常二倍体成纤维细胞（TIG3）的细胞增殖能力时，发现 BioSera 品牌的 Exosome-Depleted FBS 比起其他市售产品，拥有更好的细胞增殖能力（图 2（b））。

 

 

 

图 2. 去除外泌体 FBS 的评价

 

（a）使用 PS 亲和 ELISA 检测 FBS 中的牛来源外泌体：生物素标记 抗 CD9 抗体（1K）、抗 CD81 抗体（17B1），然后用 PS Capture™ Exosome ELISA Kit（ Streptavidin HRP）的检测抗体置换。使用的 FBS 分别是未经任何处理的样品、经超速离心处理的样品（120,000×g，18 h）、2 种其他品牌去外泌体 FBS、以及 BioSera 品牌 Exosome-Depleted FBS 的原液、10 倍稀释产品和 100 倍稀释产品。信号值大于 4，表示超出检测范围。

（b）评价去除外泌体的 FBS 的细胞增殖能力：添加 10％ 浓度的各 FBS（未经任何处理的样品、经超速离心处理的样品、2 种其他品牌去外泌体 FBS、和 BioSera 品牌 Exosome-Depleted FBS）至 D-MEM（低糖型）培养基中，然后培养 TIG3 4 天。计算接种 3 天后和 4 天后的活细胞数。

 

 

◆结语

 

本次我们通过高灵敏度的 PS 亲和 ELISA 和交叉性识别牛外泌体表面标记抗原蛋白的抗体的各种组合，确立了能高灵敏地检测 FBS 中牛来源外泌体残留量的检测系统。不仅发现了在普遍使用的去外泌体 FBS 中，仍残留着大量的牛来源外泌体，还发现了使用现有外泌体检测技术难以证明有无外泌体残留并保证产品质量。
 

当然，实验人员都会担心混入细胞培养上清中的牛来源外泌体会对下游的实验和分析的背景产生巨大的影响。因此，我们认为使用高灵敏度 PS 亲和 ELISA 可以确保高质量的 FBS，或使用几乎完全去外泌体的 BioSera 品牌的 Exosome-Depleted FBS，能够获取重复性良好且准确清晰的研究数据。
 

最后，希望今后通过有效运用 FUJIFILM Wako 提供的高灵敏度 PS 亲和 ELISA 以及 BioSera 品牌的 Exosome-Depleted FBS，为外泌体相关的研究做出贡献。

 

 

（备注：BioSera 品牌 Exosome-Depleted FBS 尚未在中国地区出售）

 

 

 

◆参考文献

 

1) Colombo, M. et al. : Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30, 255 (2014).

2) Tkach, M. et al. : Cell, 164, 1226 (2016).

3) Raimondo, F. et al. : Proteomics, 11, 709 (2011).

4) Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935 (2016).

 

◆产品列表

 

产品编号	产品名称	规格	包装
PS亲和法对应ELISA试剂盒
297-79201	PS Capture ™ Exosome ELISA Kit（Anti Mouse IgG POD） PS   Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（抗小鼠 IgG POD）	基因研究用	96 tests
298-80601	PS Capture ™ Exosome ELISA Kit（Streptavidin HRP） PS Capture™ 外泌体 ELISA Kit （链霉亲和素 HRP）	基因研究用	96 tests
生物标记抗体
014-27763	Anti CD9, Monoclonal Antibody（1K） 抗 CD9 单克隆抗体（1K）	基因研究用	100 μL
011-27773	Anti CD81, Monoclonal Antibody（17B1） 抗 CD81 单克隆抗体（17B1）	基因研究用	100 μL

 

 

相关产品链接：

 

PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠 IgG POD）

PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素 HRP）

Wako 细胞外囊泡研究工具

细胞外囊泡标记，单克隆抗体

 

 

※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。