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Western Blotting老踩坑？一篇搞定常见问题
人阅读 发布时间：2024-04-16 16:48
◆Western Blotting实验失败缘由？
Western Blotting是生命科学研究的基础实验方法，实验中的蛋白量、抗体、凝胶、膜和检测反应等因素均可能导致实验失败，但初学者往往不知道原因所在。
“我不知道Western Blotting失败的原因是什么“
“我想知道解决方案！“
针对Western Blotting的各种问题，本文整理了在转膜、抗体反应、检测等过程中的常见问题及解决方案。
◆Western Blotting常见的失败案例
以下为Western Blotting常见的失败案例：
● 高背景
● 出现漫反射带
● 转膜不均匀
下面将分别介绍它们的原因及相应的解决方案。
高背景
原因 |
解决方案 |
洗涤不充分 |
● 增加洗涤次数 ● 增加洗液体积 ● 延长洗涤时间 ● 确认Tween® 20 (*)浓度 |
无法阻断非特异性结合 |
● 重新调节封闭温度和时间。室温下1 h，4℃下过夜 ● 添加Tween® 20 (*) ● 使用添加Tween® 20 (*)的封闭缓冲液（TBS-T、PBS-T） ● 使用高灵敏度发光试剂（Immunostar® 系列） |
膜处理不当 |
● 对膜进行必要的前处理 ● 使用干净的镊子和手套，注意不要损坏膜。 ● 孵育时振荡 ● 使用低背景且可高灵敏度检测靶蛋白的CLEARTRANS® 系列产品 |
因设备、器皿的污垢造成的污染 |
● 充分清洗转膜装置、电泳槽等设备，操作过程中佩戴手套 |
强化学发光信号 |
● 缩短检测的曝光时间 ● 缩短检测试剂的反应时间 ● 降低检测试剂的浓度 |
(*) ICI Americans社的注册商标
出现微笑条带和扭曲条带
原因 |
解決方案 |
电压过高发热 |
● 降低电压进行电泳 |
盐浓度不同 |
● 盐浓度越高，移动速度越快，需统一样品的盐浓度 |
上样量不同 |
● 统一各个孔的上样量 |
有空孔 |
● 在空孔中上样相同盐浓度、相同液量的样品，或仅上样样品缓冲液 |
出现漫反射带
| 原因 | 解决方案 |
| 受到样品溶液中变性剂和表面活性剂的影响 | ● 确认样品的提取和制备过程 |
| 样品存放时间久，存储方法不当，导致蛋白降解 | ● 确认样品的制备时间和存储方法 |
| 转膜时间过短 | ● 如果所有条带出现相同现象，可能是转膜时间短，需要延长转膜时间 |
| 蛋白量过高 | ● 调整蛋白上样量和浓度 |
转膜不均匀
原因 |
解决方案 |
凝胶和膜之间有气泡 |
● 使用滚筒等去除气泡 |
转膜设备的问题 |
● 使用半干式设备时，反复使用会导致转膜板弯曲，建议返厂维修或更换新的设备 |
转膜方法的问题 |
● 半干式设备容易引起转膜不均匀的问题，可尝试更换为湿转仪 |
◆其他失败案例的原因及解决方案
其他的失败原因、解决方案如下所示。
● 条带模糊、不清晰
● 条带空白
● 信号弱、无信号
● 背景有斑点和污渍
● 丽春红染色效果差
下面将分别介绍它们的原因及相应的解决方案。
条带模糊、不清晰
原因 |
解決方案 |
蛋白量过高 |
● 降低电泳的蛋白量 |
抗体浓度高 |
● 降低一抗、二抗的浓度 |
检测信号高 |
● 缩短曝光时间 ● 缩短检测试剂的反应时间，反应后尽可能去除试剂 ● 降低二抗浓度 |
条带空白
原因 |
解決方案 |
蛋白量高 |
● 减少蛋白量 |
抗体浓度高 |
● 降低一抗、二抗的浓度 |
信号弱、无信号
原因 |
解決方案 |
抗体失活 |
● 检查抗体存储状态，时间 ● 重新进行抗体反应时，推荐使用10 min即可去除抗体的“WB膜再生液“ |
抗体结合力不足 |
● 确认抗体的稀释浓度是否合适 ● 延长抗体反应时间 ● 对于低蛋白表达量的样品，可增加电泳量，提高抗体浓度 ● 使用抗原抗体反应促进试剂 ● 更换高效转膜缓冲液 |
叠氮-化钠抑制酶反应 |
● 叠氮-化钠会抑制HRP的活性，因此抗体中含叠氮-化钠时，需要稀释抗体以降低叠氮-化钠浓度或使用不含叠氮-化钠的抗体 ● 使用HRP标记一抗且阻断剂中含有叠氮-化钠时，需在封闭后使用 TBS-T清洗再进行抗体反应 |
曝光时间短 |
● 延长曝光时间 |
封闭时间不当 |
● 封闭时间过长时，封闭剂会遮盖抗原，降低抗体反应性，因此需要确认封闭时间是否合适 |
转膜效率低，无法转膜 |
● 延长转膜时间 ● 靶蛋白的分子量较高时(例：100 kD以上)，添加0.1%的SDS(十二烷基硫酸钠) ● 使用预染蛋白Marker作为阳性对照，确认转膜效率 ● 使用具有抗体结合位点的分子量Marker作为阳性对照 |
检测试剂的化学发光弱 |
● 确认检测试剂是否变质 ● 使用高灵敏度的发光试剂“ImmunoStar®系列“ |
背景可见斑点和污渍
原因 |
解决方案 |
镊子被污染 |
● 镊子上的污垢会附着在膜上形成背景。需使用经乙醇消毒后的干净镊子夹住膜的边缘 |
洗涤不充分 |
● 增加洗涤次数和洗液体积 |
抗体反应不当 |
● 增加抗体反应溶液，并振荡使其反应 |
检测设备被污染 |
● 检测前，使用乙醇擦拭放置膜的样品台，去除污垢 |
丽春红染色效果差
原因 |
解决方案 |
蛋白未转膜 |
● 确认转膜设备是否正确运行 ● 确认膜和凝胶是否正确接触 |
低蛋白量 |
● 增加蛋白的上样量 |
染色试剂变质 |
● 检查染色试剂的有效期 ● 更换凝胶染色试剂（Negative Gel Stain MS Kit、Ponceau 3R、Ponceau-3R Stain Solution、Amido Black 10B） |
◆Western blotting必备产品
● 封闭用脱脂奶粉
● 高效转膜液
● WB专用膜
参考文献
● Rasheed Sule. et al. : Future Science., 75, 99 (2023)
● Habeebunnisa Begum. et al. : Future Science., 73, 58 (2022)
● 岡田雅人, 三木裕明, 宮崎香：「無敵のバイオテクにカルシリーズ 改訂第4版 タンパク質実験ノート 下」p.44 (羊土社)
● 西方敬人：「バイオ実験イラストレイテッド⑤」p.165 (秀潤社)
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